MPlexAnalyzer

Intelligente Software zur Auswertung zytometrischer Multiplex-Assays

Design eines Bead-basierten Multiplex-Immunoassays für die Durchflusszytometrie. Die Beads werden mit Fängerantikörpern beschichtet, die jeweils spezifisch für ein Analyt sind. Wenn dieses gebunden ist, wird über den sekundären Antikörper ein Antigen-Sandwich aufgebaut.

Die im Durchflusszytometer gemessenen Fluoreszenzintensitäten der Beads werden den Analyten zugeordnet. Gelb markiert sind die Mittelwerte der Populationen.

Gemessene Konzentrationen aufgeschlüsselt nach Analyt und Probe.

Multiplex-Assays erlauben die simultane Bestimmung einer Vielzahl von Proteinen in einem Versuchsansatz. Dabei entstehen vielschichtige Datensätze, die in manuellen Einzelschritten ausgewertet werden müssen. Hier hilft spezialisierte Software wie MPlexAnalyzer, eine für industrielle Partner entwickelte Lösung. 

Das Immunsystem nutzt eine Vielzahl von Signalgebern für die Kommunikation unter Zellen. Bestimmte Botenstoffe lösen spezifische Immunantworten aus und helfen auf diese Weise dabei Erreger abzuwehren, die in den Körper eindringen. Dabei ist aber immer nicht nur ein Signalgeber verantwortlich für den Gesamtzustand des Immunsystems, sondern eine Kombination von vielen verschiedenen. Forscher brauchen also Methoden, mit denen sie möglichst viele Botenstoffe im Kontext untersuchen können.

Ein Ansatz sind zytometrische Multiplex-Assays, mit denen bis zu 20 immunologische Parameter simultan aus Serum, Plasma-Proben oder Zellkulturüberständen identifiziert werden können. Herzstück dieser Assays sind mit Antikörpern beschichtete Kügelchen (Beads). Die Antikörper sind biologische Fängermoleküle, jedes spezifisch für ein nachzuweisendes Protein. Ein Antikörper eines bestimmten Typs wird mit einem Bead kombiniert, das eine fest definierte Größe und Fluoreszenzeigenschaft hat. Dadurch können die Beads später in einem Zytometer leichter voneinander getrennt und einem nachzuweisenden Protein zugeordnet werden.

Der Vorteil des Multiplex-Verfahrens liegt auf der Hand: Es können viele Parameter gleichzeitig analysiert werden. Das spart Zeit und vor allem Probenvolumen. Außerdem muss die Probe nur einmal für die Analyse vorbereitet werden, wodurch wiederum viel Zeit bei der Handhabung gespart wird. Ein dritter Vorteil ist, dass die Daten im Kontext betrachtet werden können und so mehr Informationen liefern als die Einzelwerte.

Auf die Fragestellung zugeschnittene Software

Je mehr Parameter gleichzeitig ausgewertet werden, desto schwieriger ist es, den Überblick zu behalten. Es soll eine statistische belastbare und vor alle reproduzierbare Aussage getroffen werden. Hier hilft die MPlexAnalyzer Software, die speziell für die Analyse von Bead-basierten Assays entwickelt worden ist.

In MPlexAnalyzer kommt ein Wizard-Konzept zum Einsatz, das den Nutzer schrittweise durch die Auswertung führt. Der Arbeitsablauf wird auf so auf das Wesentliche reduziert und die Auswertung deutlich vereinfacht. Im ersten Schritt werden die gemessenen Beads anhand ihrer Größe (Forward Scatter) und des abgestrahlten Fluoreszenzlichts (Side Scatter) unterteilt. Die Software erstellt hierzu automatisch einen Vorschlag. Ein Clustering-Algorithmus findet die optimale Unterteilung und schließt selbstständig Rauschen oder Verschmutzungen aus. In der Regel muss der Nutzer den Vorschlag nur optisch kontrollieren. Ein großer Vorteil bei diesem Ansatz liegt in der Reproduzierbarkeit der Ergebnisse gegenüber einem manuellen Verfahren. Da Messungen aus mehreren Tausend Einzelwerten bestehen, können bereits leichte Abweichungen bei der manuellen Auswahl einen Effekt für die spätere Auswertung haben, den der Nutzer in diesem Schritt nicht absehen kann. Der Computer hingegen arbeitet immer gleich.

Im nächsten Schritt werden die einzelnen Populationen anhand der Fluoreszenzemissionen der Beads weiter unterteilt und den Messparametern zugeordnet. Auch hier macht die Software einen reproduzierbaren Vorschlag. Die Zuordnung zu den Analyten erfolgt ebenfalls automatisch, da die Software das Wissen über die verwendeten Beads bereits mitbringt. Das Ergebnis der Auswertung wird graphisch dargestellt und während der folgenden Kontrollen live angepasst. Dieses direkte Feedback erlaubt, etwaige Messfehler zu identifizieren und gegebenenfalls auszuschließen.

Interaktives Feedback und Reporting

Aus den Ergebnissen der zweiten Unterteilung wird dann über Standardkurven auf die Konzentrationen der untersuchten Analyte zurückgeschlossen. Diese Standardkurven werden in der Regel für jede Messung neu anhand bekannter Konzentrationen erzeugt, um beispielsweise Effekte durch die Verwendung unterschiedlicher Zytometer auszuschließen. MPlexAnalyzer bietet verschiedene mathematische Modelle an, um zwischen den vermessenen Standardwerten zu interpolieren. Fehlmessungen und Ausreißer lassen sich an dieser Stelle ausschließen. Ein Maß für die statistische Güte der Standardkurven wird bei jeder Veränderung eingeblendet. Umgekehrt kann der Nutzer auch ein Gütekriterium vorgeben, das von der Kurve erfüllt werden muss, und erhält eine visuelle Warnung, wenn dies für einzelne Segmente nicht der Fall ist.

Die Ergebnisse werden abschließend in einen zusammenhängenden Report verwandelt. Alle relevanten Informationen und vom Nutzer getroffenen Entscheidungen sind hier hinterlegt. Zusätzlich kann der Nutzer aus einer Vielzahl von Visualisierungen wählen und das Layout des Reports nach seinen Vorstellungen anpassen.